Laboratorio del corso di Biochimica del Metabolismo
Corso di Laurea in Biotecnologie
Produzione di una Proteina Ricombinante
- Gel elettroforesi in poliacrilammide
- Un importante
controllo è costituito dall'analisi elettroforetica in gel di poliacrilammide
in presenza di SDS (sodio dodecil solfato). Una breve
descrizione della tecnica è contenuta in questa animazione.
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Informazioni utili
- Alcune informazioni sulla struttura della matrice che costituisce il gel di poliacrilammide: si ottiene copolimerizzando due monomeri, l'acrilammide e la N,N'-metilenebisacrilammide
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Formazione e struttura molecolare della matrice di poliacrilammide. - La reazione viene innescata da radicali liberi che, di solito, vengono prodotti dall'aggiunta di ammonio persolfato (il quale genera radicali SO4-.). Questi radicali attivano il TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiammina), una sostanza organica introdotta precedentemente nella soluzione. Il TEMED è quindi in grado di interagire con il monomero di acrilammide producendo un nuovo radicale che a sua volta può reagire con una molecola di acrilammide o di bisacrilammide. L'ossigeno destabilizza i radicali e quindi tende ad inibire la reazione. Anche per questo motivo in alcuni protocolli si consiglia di disaerare le soluzioni; questa operazione non è essenziale e può essere compensata da un aumento della quantità di persolfato.
La formazione di legami covalenti fra molecole di acrilammide produce catene la cui lunghezza è determinata dalla concentrazione del monomero. La bisacrilammide invece, possedendo due identici gruppi funzionali, è in grado di stabilire dei ponti fra le catene di poliacrilammide formando il caratteristico reticolo tridimensionale del gel. La porosità del gel dipende ovviamente sia dalla concentrazione che dal rapporto delle due molecole. In generale, la concentrazione di acrilammide nella miscela di reazione varia fra il 3.5 e il 20% mentre il rapporto bisacrilammide/acrilammide è di solito circa 1/30.
Il gel elettroforesi in poliacrilammide, in presenza del detergente anionico denaturante SDS (sodio dodecil solfato), è il metodo principe per la separazione di proteine in base al peso molecolare. E' forse importante ricordare le funzione chiave dell'SDS: la denaturazione delle proteina e il rivestimento dei polipeptidi denaturati. Conseguentemente, in un campo elettrico, indipendentemente dalla carica data dalla particolare composizione amminoacidica, essi si muoveranno sempre in una unica direzione, cioè il polo positivo, con una velocità che dipenderà dalle loro dimensioni. Nel gel, i polipeptidi di dimensioni maggiori si muoveranno più lentamente con una velocità di migrazione correlabile al peso molecolare.
- L'analisi elettroforetica della SYFP purificata, quindi, fornirà informazioni sulla presenza di altri contaminanti (perchè si muoveranno con una velocità diversa) e sulla loro concentrazione relativa (deducibile dalla intensità delle bande nel gel dopo colorazione). Il confronto fra le varie frazioni permetterà anche di capire quali passaggi siano stati più efficaci per la purificazione e quali potranno, eventualmente essere migliorati.